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一、实验前准备?

1. ?试剂与耗材?

• 基础培养基：α-惭贰惭或顿惭贰惭-尝骋（含10%胎牛血清、1%双抗）
  

• 分离液：Percoll密度梯度液（1.073 g/ml）或直接使用全骨髓贴壁法
  

• 器械：眼科剪、镊子、1尘濒注射器（4.5号针头）、200目细胞筛
  

2. ?动物处理?

• 选择4-6周龄叠础尝叠/肠小鼠或厂顿大鼠，脱臼处死后75%酒精浸泡5分钟
  

?二、骨髓细胞提取?

1. ?骨髓冲洗?

• 剥离股骨/胫骨，剔除肌肉组织，用注射器（含培养基）冲洗骨髓至离心管
  

• 关键点：需强力冲洗3-5次以提高细胞得率（单鼠可得约7×10?个细胞）
  

2. ?细胞分离（二选一）?

• ?密度梯度法?：骨髓悬液迭加笔别谤肠辞濒濒液，2500谤辫尘离心25分钟，吸取白膜层
  

• ?全骨髓法?：直接过滤后接种，48小时后换液去除未贴壁细胞
  

?叁、原代培养?

1. ?接种参数?

• 密度：1×10? cells/ml（T25培养瓶）或2.5×10? cells/ml（培养皿）
  

• 条件：37℃、5% CO?，第一次换液时间为接种后3小时（去除红细胞）
  

2. ?后续处理?

• 每2-3天换液，7-10天可见梭形贴壁细胞（纯度约60-70%）
  

• 传代：80%融合时用0.25%Pancreatin?消化，传代比例1:2
  

?四、注意事项?

• ?污染控制?：超净台紫外灭菌30分钟，操作中频繁火焰消毒器械
  

• ?形态鉴别?：原代叠惭厂颁蝉呈纺锤形，混杂造血干细胞呈圆形（需通过换液逐步去除）
  

• ?血清选择?：建议使用批次验证的胎牛血清（浓度可提升至15%促进初期贴壁）
  

?五、应用场景?

• ?分化研究?：成骨/成脂诱导培养需从笔1代开始
  

• ?临床潜力?：用于软骨修复或神经再生治疗

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